摘要：每天2次注射FSH，进行牛的超排必须处理得当，否则由于基层技术人员的误操作将提高超排失败的可能性。我们设计了3个试验，应用透明质酸为基础的缓释物（SRF）稀释促卵泡素V，然后单次肌肉内（IM）注射肉牛，进行超排效果的评估。试验1，将奶牛分成3组，进行每天2次的注射程序与2种注射方法的对比研究；为期4天，每天2次（对照组）的IM的牛（n=6）的超排反应，大于单次皮下（注射SC）SRF（n=6），而奶牛（n=6）单次IM的SRF的反应位于两者之间。试验2，比较单次IM注射程序中，两种SRF的浓度（20mg/ml的透明质酸，100% 对比10mg/ml的透明质酸，50%）影响。结果黄体（CL）的平均数没有显著差异（P≥0.05），但总的卵子/胚胎数（P＜0.05）、受精卵（P＜0.01）和可移植胚胎数（P＜0.001），100% SRF处理组（n=20）是优于50% SRF处理组（n=20）。试验3，在红色安格斯奶牛上对比单次IM 100% SRF 稀释的FSH效果，与传统的为期4天，每天2次的超排效果。CL的平均数（13.7±1.2 VS 13.8±1.2），总胚胎数（12.3±1.5 VS 13.7±1.2），受精卵（7.2±1.1 VS 8.4±1.4）和可移植胚胎（4.9±0.8 VS 6.4±1.3），在对照组（n=29）和单次注射组（n=29）中没有显著差异。
1. 前言
肉牛超排处理的主要目的是诱发更多的排卵，致使产生更多的可移植胚胎和移植后的更高妊娠率。然而，供体对于促性腺激素的处理有很大的变异性，其对胚胎移植也有主要的影响。最近对发情周期和卵泡波的研究进展表明，在卵泡波启动的时候用激素处理将获得较好的超排效果，卵泡波的同期启动方法现在已有较优的设计。
供体牛的超排处理可以通过传统的单次IM 孕马血清促性腺激素（eCG），或者每日2次IM垂体提取物FSH来实现，孕马血清促性腺激素是一种复杂的糖蛋白激素，其半衰期为40小时，单次注射可引起超排；而FSH在奶牛体内的生物半衰期不足5小时，必须多次处理才能诱发超排。用垂体提取物每日2次的IM处理的超排反应优于每日1次的处理。因此，垂体衍生物激素的处理必须谨慎，否则由于错误处理货注射将提高失败的可能性，另外，每日两次的处理将引起供体牛的过度应激，这将使得以后的超排反应逐渐减弱。故简单的卵泡超排程序将有望减少供体牛的超排处理费用，提高其反应能力，尤其对不易处理的动物而言。
用垂体粗提物（FSH-P），以明胶盐为媒介稀释后一次性快速注射后的效果类似于每日两次，共5天的超排程序，然而，这单次注射的产生的可移植胚胎数非常少。其他人也用FSH氢氧化铝凝胶或聚维酮制剂的，但其结果不稳定。然而，也有一个担忧就是垂体提取物和这些集合物的超排，可能使得牛体内产生对FSH 的抗体物。
单次注射FSH程序将是传统的每日2次处理程序的牛超排处理的选择途径之一，单次处理程序可能更加适用于缺少技术人员的牛场。在一项使用垂体纯提取物，促卵泡素V超排研究中，单次皮下注射400mg NIH-FSH-P1肉用奶牛的媒介物，体况较高（＞3/5）的牛的超排反应与传统的每日2次、共4天的处理结果相似，然而，此结果在有较少皮下脂肪组织的荷斯坦奶牛上未能重复。在另一项荷斯坦奶牛的研究中，单次注射的FSH-V被分成2份，在处理的第一天皮下注射75%，48小时后注射剩余的25%，而前列腺素是正常注射，超排反应与传统的4天处理程序没有不同，促卵泡素V的单次皮下注射与牛的体况和性情有关，更易接受超排处理的牛将会得到更优的效果。
一个可选用的稳定的单次FSH注射的超排反应应该是将促卵泡素V和可生物降结合解的高分子聚合物相结合，来维持在几天内稳定慢速的释放激素。有好几种生物或合成的不同材料性质的聚合物可用于维持药物的缓慢释放，这些物质是可降解的，对生物体组织没有免疫反应，适合于在动物体内使用，其中一种就是以透明质酸为基础的物质（SRF），在以前的研究中，就将促卵泡素V用SRF稀释后单次注射进动物体，可诱发超排反应。一系列的实验设计-评估使用SRF稀释的促卵泡素V单次IM后，肉奶牛的超排反应，主要目的是确定使用SRF稀释后的促卵泡素V单次注射的位点，对超排反应的稳定性（试验1）；比较两种不同浓度的SRF的IM注射结果（实验2）；在安格斯奶牛上，比较注射SRF稀释后促卵泡素V和注射每日两次的生理盐水，证实前者诱发超排反应的能力。
2. 材料与方法
实验1是用SRF稀释后的促卵泡激素V注射不同位点的比较，杂种肉用奶牛（n=18）被随机的分成3组，在第0天（开始处理天），所有的奶牛注射5mg 17β-雌二醇和50mg孕激素，并植入含1.56g 孕激素的阴道栓，在第4天，按以下处理进行奶牛的超排处理：第一组（对照组）：用生理盐水稀释400mg的 NIH-FSH-P1，每天2次颈部IM注射逐渐递减注射4天（80，80,60,60,40,40,20,20）；第二组：用10ml的SRF（20mg/ml 透明质酸）稀释400mg的 NIH-FSH-P1颈部IM注射； 第三组：在用10ml的SRF稀释400mg的 NIH-FSH-P1耳部皮下（SC）注射。对于单次注射，是先将促卵泡素V用1ml的生理盐水稀释，然后注射进含有9ml、浓度为22mg/ml 的透明质酸的小瓶中，轻微摇匀，并吸进12ml的注射器中进行注射。在第6天的早上和下午（FSH开始处理后的48小时），所有牛注射150mg PGF，并在下午撤栓。在第8天的早上注射12.5mg的LH，并在12和24小时后进行输精。如果奶牛在第7天下午稳定接受爬跨，12小时后进行LH的注射和输精，在第15天非手术法收集胚胎，并按照IETS的方法评估质量，IETS评估质量为1和2级的胚胎则认为是可移植的胚胎。
实验2是比较2种不同SRF浓度通过单次IM注射促卵泡素V后超排反应，实验分2阶段进行处理，第一阶段，15头红色安格斯奶牛按交叉设计进行两次超排处理，第二阶段，10头红色安格斯奶牛随机分成两组，进行一次超排处理，在第4天时，按照实验1的单次处理程序用400mg的NIH-FSH-P1进行颈部IM注射，单次注射的试剂是将促卵泡素N的冻干粉末用1ml的生理盐水稀释，然后在12ml的注射器中与9ml的SRF（22mg/ml 透明质酸，100%溶液）或者50%的SRF稀释（11mg/ml 透明质酸，50%溶液）在处理前混匀。输精、胚胎采集和评估均按照实验1的进行处理。
实验3是证实前面的结果，并比较用100%的SRF稀释的促卵泡素V的单次IM注射和传统的生理盐水稀释的促卵泡素V的每日2次的IM注射对红色安格斯供体奶牛的超排影响，实验分两个阶段：第1阶段，17头红色安格斯奶牛按交叉设计进行两次超排处理，第二阶段，24头红色安格斯奶牛随机分成两组，进行一次超排处理，在第4天时，按照实验1的用400mg的NIH-FSH-P1按每日两次为期4天的递减或按单次进行颈部IM注射，单次注射的试剂是将促卵泡素N的冻干粉末用1ml的生理盐水稀释，然后在12ml的注射器中与9ml的SRF（22mg/ml 透明质酸，100%溶液）在处理前混匀，同实验2。输精、胚胎采集和评估均按照实验1的进行处理。
2.1 超声波
所有的奶牛在第0天和第4天检查黄体的存在，卵泡的大小和数量，奶牛的卵巢在超排处理期间（4-8天），每天都进行卵泡生长特性的超声波检测，在11天检测排卵数量，在15天通过直肠检查黄体数量来证实超排反应。
2.2 统计分析
实验1中的数据（连续的状态分布和变异）按ANOVA进行评估，平均数通过LSD测试进行比较，实验2和3的数据通过平方根被初步转化，然后使用Infostat进行ANOVA分析，通过保护LSD测试进行平均数的比较，ANOVA混合模式检测天数、处理和天数与处理互作对≥9mm卵泡直径和数量的影响，处理组间平均卵泡直径的统计比较、每头牛的平均卵泡直径在卵巢上出现大于3mm的卵泡时开始进行测试。
3. 结果
实验1的结果如表1所示，总胚胎数、受精卵和可移植胚胎数，用400mg FSH按每日2次为期4天的IM注射比按400mg FSH单次耳部SC注射效果显著好（P＜0.05）。而用单次IM注射后获得的总胚胎数、受精卵和可移植胚胎数处于中间水平，与其它处理组间没显著差异。图1表示了在超排处理期间直径≥9mm的平均卵泡数。在所有的处理组中，直径≥9mm的平均卵泡数在第5-8天时增加（即在第一次FSH处理后的24小时），此后则减少（天的影响，P＜0.001），此外，在6-8天，用每日2次IM注射促卵泡素V的方法，将有更多的≥9mm的卵泡生成。
在试验2，在第1和2阶段之间，没有差异，所以将数据结合在一起。尽管CL的平均数没有显著的差异，但总的卵子/胚胎数（P＜0.05）、受精卵（P＜0.01）和可移植胚胎数（P＜0.001）用100% SRF溶液的比50% 的要好的多（表2）。在胚胎采集时，50%SRF组中的2头牛和100%中的1头牛，其黄体数小于2；此外，50%SRF组中20头牛里的8头奶牛（40%）没有产生任何可移植的胚胎，而100%组中的所有奶牛都产生了至少一枚可移植胚胎。
在处理期间卵泡的特性没有什么不同，在注射促卵泡素V的当天直径在3-5mm的卵泡数（第4天； 18.6±1.5 VS 16.4±1.6），排卵数（13.2±1.1 VS 10.4±1.4），LH处理后的平均排卵时间（30.8±1.3h VS 30.1±2.6h）在100%SRF 稀释组和50%稀释组组间没有显著差异，然而，所有直径＞3mm（P=0.0662；图2）和≥9mm（P=0.08994；图3）的卵泡在处理期间都倾向有时间和处理之间的互作作用，使得在第7天和第8天，用100% SRF 稀释的促卵泡素组比50%的组有更大的平均卵泡直径值（图2）和≥9mm的卵泡数（图3）。
在试验3中，在第1和2阶段之间，没有差异，所以将数据结合在一起。CL的数量、总胚胎数、受精卵数和可移植胚胎数在组间没有差异（P＞0.05；表3）。在胚胎采集时，每组各有1头牛其黄体数≤2，对照组中有1头和单次注射组中有2头奶牛没产生任何可移植胚胎。
在处理期间组间卵泡特性没有什么差异，所有直径≥3mm（图2）的卵泡的平均直径，直径在3-5mm、6-8mm和≥9mm的卵泡数都受到天数的影响（P＜0.001），但是组间没有显著的差异，也没有互作影响。此外，在注射促卵泡素V的当天直径在3-5mm的卵泡数（第4天；19.6 ± 1.5 VS 17.6 ± 1.3)，排卵数 (15.8±1.3 VS 14.5 ±1.7) LH处理后的平均排卵时间 (31.3± 2.3 h VS 35.1 ± 2.3 h)，在对照组和单次注射组之间没有显著差异。
4 讨论
总的结果显示，用20mg/ml的透明质酸（100%的SRF溶液）稀释促卵泡素V，并进行单次IM注射后，对红安格斯供体牛有更好的超排效果，在产生的胚胎总数和可移植胚胎数上，与传统的每日2次的IM注射的效果没有显著差异。值得注意的是在实验2和3中，49头牛用100% SRF稀释促卵泡素V后进行单次注射后，仅有4头（8%）没产生任何可移植胚胎，这比以前报道的相关肉牛（24%）和荷斯坦奶牛的每日两次IM注射的数值要小。实际上，在实验3中，每日两次IM注射的29头超排牛对照组中，仅有3头（10%）没有产生可移植胚胎，显然和单次IM注射的超排反应组之间没有差异。
注射后血液中的FSH浓度，由于处理吸收位点和代谢清除的不同而异，按照代谢率，预测FSH以相同的速率被清除，而无论处理的方法和浓度如何。垂体提取物的快速吸收将导致其清除的速率加快，因此，卵泡在较大浓度的FSH的生长时间减少，不能维持在排卵前。以前的文献结果显示，促卵泡素V生理盐水稀释、并在单次IM或SC注射后（瘦肉型动物），血液中FSH达到相似的高浓度，并比体况较好接受了单次SC注射的奶牛体内的FSH下降更快，推测是由于体况好的奶牛吸收较慢的原因。将FSH用聚乙烯比咯烷酮稀释，比对照的生理盐水稀释将导致其吸收更慢、时间更长、血液中FSH浓度更高。我们推断将促卵泡素V和透明质酸混合也将减缓吸收速度，维持血液中FSH的较高水平，因此，在单次注射促卵泡素V诱发超排反应中，FSH的吸收速率是影响因素，而不是清楚的速率。
试验1的结果显示，将促卵泡素V和透明质酸混合单次SC耳部注射，没有产生较好的效果，但单次的IM注射和目前已接受的每日2次的生理盐水稀释的处理效果没有显著的差异（尽管在数值上小一点），然而，将促卵泡素V和透明质酸混合的方法将值得参考，20mg/ml的透明质酸（100% SRF）溶液是非常粘稠的，其混合促卵泡素V后是可以观察的到的，所以不可能从小瓶中完全的抽吸出来，因此推断单次IM注射后较低的超排反应可能是由于FSH比原计划的剂量小的缘故，此推论从卵泡的生殖特性上可证实，尽管在激素处理开始时，起初的卵泡（3-5mm）数量没有差异，而达到9mm或更大直径的在单次注射组是较少的（图1），故比促卵泡素V和20mg/ml的透明质酸混合的方法外，还需探索一种更易吸取的方法，这也是我们在实验其中使用较低浓度（10mg/ml透明质酸；50% SRF）的透明质酸的原因，50% SRF溶液不是十分粘稠故更容易从小瓶中吸取。
在实验2和3中，在注射器内混合生理盐水中的促卵泡素V和SRF溶液，对超排反应更加有效。然而，50%的SRF溶液比100%的超排效果不佳，在实验2中，卵泡的直径特性显示用50%的SRF溶解促卵泡素V可诱发超排反应，但卵泡的生长似乎在延迟2天后（第6天；图2），比100% SRF组（图3）出现了较少的能达到排卵大小的卵泡，推测是由于在后半部分处理时，FSH不足的原因，正如以前在荷斯坦奶牛上用生理盐水稀释的促卵泡素V皮下处理的效果一样。
在实验3中，与传统的每日2次共4天的IM注射程序相比较，应用20mg/ml的透明质酸（100% SRF）稀释促卵泡激素V后单次IM注射的效果也非常有效。在各测试的项目上，两组间没有显著的差异，与以前文献中报道的每日2次处理程序后的可移植胚胎数相比，其数量很高。值得注意的是在处理初期，对FSH易反应的卵泡（直径为3-5mm）数量在两组间没有差异，事实上，对照组的数量还占优。另外，两组间的排卵数和LH处理后到排卵的时间间隔上都没有差异，两组间无差异的卵泡生长特性显示了单次IM注射促卵泡素V可为卵泡的生长至排卵阶段提供充足的FSH。
实验3是一个用透明质酸稀释促卵泡激素V后单次注射诱发奶牛超排反应的相当严谨的测试，相比于传统的每日2次的IM注射模式，此测试不仅证实卵泡生长特性，而且在测试的各变量间，包括排卵率、胚胎产量和更主要的可移植胚胎数都没有差异，尽管单次IM注射处理中的最佳促卵泡素V的剂量没有被测试，但这与每日2次注射的剂量相似，也和以前报道的单次促卵泡素SC注射的剂量相近。
5. 结论
总的概括，相比于传统的每日2次的IM注射处理程序，用20mg/ml的透明质酸稀释的促卵泡素V单次注射后的红安格斯供体奶牛的超排反应也是较好的，对于混合促卵泡素和透明质酸的方法将是可行的，但对于安格斯牛所使用的这一剂量是否最优还不太清楚，促卵泡素V的单次肌肉内注射将减少超排处理中的劳动强度和处理程序，特别是对于难以进行超排处理操作的动物而言，此方法将更加适用。 |
